E.histolytica - катализатор начала опухолевого процесса и других осложнений

к.м.н. Свистунов О.П. – Консультант медицинского департамента АЗ АЛСКОН(Русал) в Нигерии, специалист по тропической медицине и гигиене (Университет Витс.ЮАР),врач инфекционист(РАПО.г.Москва),член Королевского Сената специалистов по тропической медицине (Англия).
Доктор Anya Kalu,доктор Ime Umoh,паразитолог лаборант Isuwu Ifeanyi госпиталь АЗ АЛСКОН в Нигерии.

Протозойная инфекция остается основной причиной высокой заболеваемости населения. Заболеваний хорошо описаных специалистами из разных стран мира, во многих статьях, разработано большое количество препаратов для лечения данной патологии.(3)

Мы изучали, параллельно, два протозойных заболевания малярию и амебиаз. Так как малярия, как правило, протекает как острый инфекционный процесс, с хорошо описанной, но не всегда классически протекающей клинической картиной, с хорошо отработанными методами диагностики и лечения, мы сделали основной акцент на изучении эпидемиологии,клиники, течении, диагностики, методов лечения и профилактики амебиаза. Основновной причиной заболевания которым, является попадание в организм человека цист E.histolytica. Исследования и лечение пациентов были проведены в целях разработки упрощенной методики диагностики амебиаза, отработать наиболее простые методы лечения амебиаза, до полного выздоровления пациента и конечно его профилактика. Так же не были изучены отдаленные последствия поражения организма человека цистами и подвижными трофозоитами - эритрофагами E.histolytica. Так как до сих пор считается , что существует бессимптомное носительство E.histolytica. C чем наша группа специалистов, не может согласиться.

2.Эпидемиология амебиаза

Эпидемиология заражения Цистами E.histolytica, как причина поражения организма человека описана многими авторами.(10,11,12,13,14) Длительное существование цист в природных очагах способствует быстрому распространению амебиаза по всему миру.В большинстве африканских стран вода является основным источником заражения. В странах с жарким влажным климатом такие как Нигерия, Камерун, Мозамбик, амебиаз имеет широкое распространение по всей территории страны. В странах с жарким сухим климатом наибольшее количество больных амебиазом в районах с открытыми источниками воды, которые использует местное население (Ливия, Кабо Верде, Южная Африка). Употребление в пищю овощей, фруктов без термической обработки способствует попаданию цист в кишечник и развитию болезни. Обслуживающий персонал ресторанов, магазинов,торговцы локальных базаров в большинстве случаев болеют амебиазом и являются источниками расспространения инфекции. Больной хронической формой амебиаза, осложненной поражением матки, простаты, легких, амебомами кишечника является постоянным источником распространения амебиаза(15).

Материалы и методы:

С марта 2007 года в Нигерии, в госпитале при алюминиевом заводе Алскон начато исследование основных причин заболеваемости рабочих завода и местного населения в районе расположения завода, в штате Аква Ибом, а также велось постоянное наблюдение за иностранными специалистами. Были обследованны пациенты из других регионов Нигерии, а также проведены исследования пациентов в других регионах Африки. Таких как Кабо Верде, Сенегал, Южная Африка, Мозамбик, Ливия,Зимбабве, Ангола,Камерун,Гана, пациентов из стран ECOWAS. А также поведен лабораторный скрининг жителей города Твери(Россия) в лаборатории 1 городской больницы.Нами были обследованы пациенты всех возрастов от детей в возрасте 1 года , до пожилых людей в возрасте 90 лет. Были обследованны школы, детские сады и пациенты в гинекологических, хирургических клиниках, сотрудники ресторанов, магазинов, базаров. За период с 2007 года по настоящее время. Обследовано 6520 (мужчин -3020, женщин – 3500; возраст от 1 года до 90 лет) жителей Центральной Африки, Юга Африки и 450 жителей России (г. Тверь, Россия). Большинство из них (5410 чел.) обследовалось на цистоносительство, хотя у части из них имелись неопределенные клинические проявления болезни.

Лабораторная диагностика

Наиболее простая форма диагностики амебиаза микроскопический анализ кала.(5,6,7) В контейнер с обьемом, не превышающим две стандарные контейнерные ложечки кала, добавляется 5 мл. физиологического раствора, контейнер взбалтывается и одна капля препарата наносится на предметное стекло, и покрывается покровным стеклом. Оценивается наличие подвижных трофозоитов и подсчитывается количество цист. Нами проведены исследования на присутствие подвижных трофозоитов в свежем анализе кала и по прошествии нескольких часов, суток. При хранении контейнера при комнатной температуре, в стуле можно обнаружить подвижные трофозоиты до 3 дней, цисты на протяжении двух недель уменьшаются в размерах и исчезают.Заключение о степени поражения организма ставится по наличию живых трофозоитов и количеству цист в 10 полях зрения. При наличии от 1 до10 цист ставится один плюс(+), при наличии от 10 до 30 цист ставится два плюса(++), при наличии 30 и более цист ставится три плюса (+++). Но это не является критерием оценки степени тяжести заболевшего. Только на основании клинической картины и дополнительных методов исследования можно судить о состоянии здоровья больного, пораженного E.histolytica.(8)

У пациентов мужского пола, детородного возраста, в случае обнаружения цист E.histolytica в стуле, рекомендуется обследовать мочу,сперму на наличие цист E.histolytica. Рекомендуется изучить препарат микроскопически, после массажа простаты , не менее чем в 10 полях зрения, без разбавления физиологическим раствором. Подсчет цист проводится по аналогичной методике как и с анализом стула.

Пациенткам, особенно с гинекологическими проблемами, проводится трехкратная микроскопия мазка со стенок влагалища и шейки матки на наличие цист и подвижных трофозоитов E.histolytica.

Дополнительные методы исследования

Всем пациентам, у кого обнаруживалась в стуле E.histolytica, проводился общий анализ крови. У пациентов, с клинической картиной анемии, множественными фибромами матки, геммороидальными кровотечениями показатели красной крови (геммоглобин, эритроциты) были значительно снижены.

Больным по показаниям проводилось гастроскопическое исследование и колоноскопия. В большинстве случаев слизистая прямой и сигмовидной кишки поражены множественными глубокими, кровоточащими язвами с гнойным содержимым. В области купола слепой кишки, при колоноскопии, можно увидеть подслизистые, желтоватого цвета множественные, напоминающие икру, зернистые образования. Размерами от 0,5 см до 3 см. На различных участках толстого кишечника можно обнаружить единичные амебные полипы. При длительном и неправильном лечении амебиаза формируются спайки и в перспективе образуется обструкция пораженного участка. Всем больным, у которых обнаружены полипы, рекомендовано проводить гистологическое исследование и удаление полипов.(16)При гистологическом исследовании необходимо дифференцировать злокачественную аденокарциному с аденокарциномой больных с хроническим течением амебиаза, вызванным E.histolytica, с обязательным исследованием биоптата на наличие цист и трофозоитов E.histolytica. В данное время признается фактически социальная важность скрининговой колоноскопии и полипэктомии, поскольку колоректальный рак занимает третье место в структуре заболеваемости и смертности от рака в мире.Благоприятный прогноз у пациентов с интраэпителиальной неоплазией, интрамукозной высокодиференцированной карциномой, при условии своевременного удаления полипа и в последствии ежегодного контроля толстого кишечника.Что отмечают и авторы (В.И. Никишаев, А.Р.Патий. И.Н.Тумак, И.А.Коляда). На сегодня мы считаем, что поражение толстого кишечника цистами E.histolytica, один из основных пусковых механизмов возникновения амебом и предраковых аденокарцином кишечника и других органов, инфицированных живыми трофозоитами-эритрофагами E.histolytica, матка, простата, органы зрения, молочная железа. Все органы, где есть гладкомышечные волокна.

Ультрозвуковое исследование и эхокардиография показаны всем пациентам с амебиазом. Ультрозвуковое исследование матки, простаты должны быть проведены всем пациентам детородного возраста. Женщинам рекомендована маммография с целью обнаружения амебом молочной железы.

Паталого-анатомическое исследование амебом матки.

У 31 одной пациентки проведены паталогоанатомическое исследование удаленных амебом матки. Гистологическая картина фибром имеет одинаковую микроскопическую картину.(15,16,17,18)

Опухоль состоит из переплетающихся в разных направлениях гладкомышечных волокон. Ядра мышечных клеток палочковидной формы с закругленными концами. Строма фиброзная в виде узких прослоек. Местами прослойки фиброзной ткани более широкие, гиалинизированные. Встречаются крупные очаги фиброза и гиалиноза, крупные толстостенные сосуды, очаги некроза опухолевой ткани, отдельные кисты без эпителиальной выстилки. Аналогичная картина в биптатах полученых при удалении амебом простаты.(20,21)

Мнение, что подвижный трофозоит-эритрофаг E.histolytica мигрирует в организме через кровь, мы считаем ошибочным, по двух причинам. Также как и малярия E.histolytica относится к классу протозойных инфекций. Клинически выброс в кровь малярийного плазмодия сопровождается целым рядом клинических симптомов. Одним из которых является высокая температура, причиной которой является реакция организма на поражение организма инородным белком. Чего не происходит при амебиазе. В большинстве случаев поражение организма E.histolytica происходит без температурного синдрома. Изучив материалы по анатомической структуре гладкомышечных волокон, мы пришли к выводу, что трофозоит-эритрофаг продвигается к полнокровным органам мишеням в интерсцитиальном пространстве гладкомышечных волокон сосудов. Электронномикроскопические исследования показали, что мембранной и протоплазматической непрерывности между отдельными волокнами мышечного синцития не существует: они отделены друг от друга тонкими (200—500 Å) щелями. Не вызывая септической реакции организма на E.histolytica,достигая органа-мишени, трофозоит- эритрофаг продолжает двигаться и наносит механическое,токсическое повреждение гладкомышечной клетке. В отличие от многоядерных волокон скелетных мышц, которые после завершения дифференцировки уже не могут делиться, гладкие мышечные волокна обладают единственным ядром и способны к делению на протяжении всей жизни организма.(22) Повреждение ткани трофозоитом-эритрофагом запускает патологическое деление гладкомышечной мускулатуры, изменяя траекторию роста гладкомышечной клетки из продольного в серповидно – кольцевое, образуя конгламерат-амебому, которая со временем начинает прорастать крупными толстостенными деформированными сосудами и и постадийно перерождается из доброкачественной амебомы в аденокарциному.

Лечения амебиаза и его осложнений

Основным препаратом, для лечения неосложненных форм амебиаза у пациентов в возрасте от 7 до 90 лет, использовался Тинидазол. Одна таблетка содержит 500 мг препарата и назначалась пациентам от одной до четырех таблеток в сутки, в зависимости от возраста и веса пациента. Препарат рекомендовано принимать одни раз в сутки, через час после приема пищи. На пять-десять дней приема. Детям в возрасте до 7 лет назначается сироп-суспензия метронидазола, по 5 мл. суспензии три раза в день на курс от 5 до 10 дней лечения, в зависимости от клиники течения амебиаза. После 15 дней терапии назначается повторный анализ кала. В случае обнаружения цист назначается повторный курс лечения. И так до полного выздоровления. В анализе кала обязательно контролируется уровень дрожжевых грибков, который, при применении противоамебных препаратов, повышается. Основным представителем которых является Candida Albicans. Хорошо лечится назначением противокандидозного препарата Флюконазол. Флюконазол назначают по одной капсуле 150 мг одни раз в день. Курс лечения назначается на 5-10 дней.

Исчезновение цист в анализах кала не говорит о полном выздоровлении пациента. Больному рекомендуется ежеквартальное исследование кала в течение одного года. С последующим исследованием кала каждые полгода жизни пациента.

Лечение осложненного амебиаза хорошо расписанно в медицинской литературе. Клиническая картина амебиаза должна дифференцироваться прежде всего с другими острыми патологиями брюшной полости (язвенный колит,болезнь Крона). Диффернициальная диагностика болей в правой подвздошной области при амебиазе и аппендиците основывается только на анализе кала. Обнаружение трофозоитов и цист в стуле пациента, является противопоказанием в операции. Только при массивном кровотечении и развитии перитонита рекомендованно оперативное вмешательство. Лечение амебных абсцессов печени,легких, мозга в большинстве случаев проводится хирургическим путем.(9) Единичные и множественные амебомы матки, простаты, молочной железы, полипы кишечника подлежат обязательному оперативному лечению, с целью профилактики перерождения доброкачественного процесса в злокачественный.

Амебиаз кожи лечится локальной обработкой пораженных участков кожи пациента 5% раствором йода до полного выздоровления, с обязательным противоамаебным курсом лечения.

Амебное поражение глазного яблока, в случае развития амебомы глазного яблока, лечится оперативным путем с повторным курсом противорецидивного лечения тинидазолом.

При обнаружении амебом в любом из органов пациента необходимо ее оперативное лечение, в целях сохранения физиологических функций органа.

Результаты

Было установлено, что среди жителей Африки только в 1450 случаях в кале не было обнаружено ни цист E. histolytica, ни ее живых форм, что составило 22,3%. Среди жителей г. Твери таковых лиц оказалось значительно больше, а именно, 330 из 450 или 73,4% (p < 0,01). Представленные данные, с одной стороны, подтверждают общее положение, что амёбиаз в странах с жарким климатом встречается чаще, а с другой, что общая частота выявляемости амёбиаза существенно превышает ту, которая указывается в литературе (1), это около 10%. При этом оказалось, что зараженность E. histolytica населения, проживающего в умеренном климате, является в целом достаточно высокой. Действительно, в 26,6% случаев у обследованных в кале имелись цисты или трофозоиты.

В свою очередь всех обследованных, у которых в кале были обнаружены цисты и трофозоиты (5190 человек) можно было разделить на 2 группы. В первую вошло 4022 обследованных. У них в кале были обнаружены только цисты, т.е. имелись цистоносительство. В целом оно имелось в 57,7% случаев независимо от места проживания. Большинство из них каких-либо жалоб не предъявляло.

Оказалось, сто интенсивность цистоносительства была различной и зависела от места проживания. Так, среди жителей Твери(Россия) цистоносительство соответствующее + имелось у 70 (71,5%) обследованных из 98, ++ у 20 (20,4%) и соответствующее +++ у 8 (8,2%). Иная картина имелась в Африке. У жителей этого континента цистоносительство, соответствующее + выявлено у 1350 (34,4%) из 3924, ++ у 1525 (38,9%) и +++ у 1049 (26,8%). Представленные данные со всей очевидностью свидетельствуют, что у жителей Африки цистоносительство встречается достаточно часто с доминированием высоких степеней обсемененности кала.

Из 4022 цистоносителей 453 человека подверглись тщательному изучению анамнеза. При этом обращалось особое внимание на наличие каких-либо событий за последние 6 мес. и связанных в основном с желудочно-кишечным трактом: боль в животе, поясничной области, понос с наличием крови и слизи в кале, общее недомогание, иногда повышение температуры. Из 453 человек с изученным анамнезом указанные явления в различных сочетаниях наблюдались за последние 6 мес. у 233 или у 51,5%. Следует отметить, что из этих 233 человек у 163 (70%) обратились к врачу. Однако ни в одном случае диагноз амёбиаза не был поставлен, и все обратившиеся к врачу обычно лечились под маской бактериальной дизентерии.

Иная ситуация наблюдалась у обследованных, у которых в кале были обнаружены трофозоиты. Из 22 жителей г. Твери ни один не чувствовал себя абсолютно здоровым. При этом в большинстве случаев жалобы носили общий неопределенный характер: недомогание, похудание, снижение работоспособности, плохой аппетит, снижение интереса к окружающей жизни и т.п. И лишь у 8 обследованных жалобы были более определенными: боли в животе, в илеоцекальной области, неустойчивый стул иногда с примесью слизи и крови. Приведенные данные дали основание к проведению дифференциальной диагностики между бактериальной дизентерией и амебным колитом (амебной дизентерией). Проведенное обследование позволило во всех случаях поставить последний диагноз. Применение тинидазола (2 грамма один раз в день) в течение 5 дней во всех случаях дало отличный результат.

Ситуация в отношении жителей Африки, у которых в кале были обнаружены трофозоиты, была следующей. Из 1139 обследованных 450 (39,5%) никаких жалоб на свое самочувствие не предъявляли и считали себя здоровыми. У 386 (33,9%) имелись жалобы неопределенного характера, однако при объективном исследовании какой-либо патологии обнаружено не было. Правда, следует отметить, что среди этих лиц довольно часто встречалось необъяснимое похудание иногда до истощения (73; 19,0%). У 303 (26,6%) имелась достаточно четкая объективная патология, которая в большинстве случаев соответствовала определенной нозологии. Из этих 303 человек у 206 (68,0%) был диагностирован амёбный колит, у 26 (8,6%) – абсцесс печени, у 15 (5,0%) – поражение кожи ног и рук в виде ее стойкой эритемы и зуда, у 6 (2,0%) – амёбома матки, у 4 (1,4%) – различное поражение глаза, у 7 (2,4%) – простатит, у 1 (0,4%) – абсцесс мозга. У 38 (12,6%) было установлено наличие амёбиаза, но последний наслаивался на другую инфекционную патологи (СПИД, малярия, филяриоз, аскоридоз, стронгилоидоз, сифилис, туберкулез и др.). Это изменяло клиническую картину амёбиаза, затрудняло диагностику. Однако нет сомнений, что сочетание амёбиаза с другой инфекционной (паразитарной) патологией, ухудшало общее состояние пациента и затрудняло лечение. Специфическое лечение во всех случаях дало отчетливый положительный эффект.

Как результат проведенного исследования отработана методика наиболее экономного метода диагностики амебиаза в условиях развивающихся стран. С высокой информативностью и упрощенного мониторинга заболеваемости населения в любом регионе мира. Рекомендована формула подсчета цист при микроскопическом исследовании в 10 полях зрения. Изучен вопрос возникновения доброкачественных опухолей различных органов матки, простаты, молочной железы, глаз, полипов кишечника с их перерождением в карциномы. Разработан наиболее экономный способ лечения амебиаза препаратом Тинидазол, рекомендована схема лечения и рекомендована медикаментозная профилактика поражения организма больного Candida Albicans, как результат противопротозойной терапии амебиаза.

Выводы

Выводы сделаные авторами, как результат клинических исследований и изучения научной литературы, лишний раз доказывают, что поражение организма человека цистами E.histolytica не может называться « носительством» амебиаза. Поражение организма E.histolytica приводит к возникновению заболевания с различной симптоматической картиной, с поражением органов и тканей везде, где есть гладкомышечные волокна. Персистирование трофозоита – эритрофага в организме приводит к ряду серьезных осложнений таких как анемия,абсцедирование, формирование множественных амебом в органах мишенях матке, простате, молочной железе, глазном яблоке, коже, единичных и множественных полипов толстого кишечника с тенденцией перерождения в злокачественные новообразования, сердечной недостаточности, нарушениям детородных функций, глубокого поражения сосудов. На основании клинических наблюдений и изучения литературных данных, сделаны выводы по возможному пути передвижения трофозоита-эритрофага в межклеточном пространстве гладкой мускулатуры органов мишеней, без клинических проявлений со стороны пациентов. Необходимо продолжить изучение процесса распространения трофозоита- эритрофага в организме человека, путем паталогоанатомического – гистологического исследования биоптатов из органов мишеней, где есть гладкомышечные волокна. Должно проводиться обязательное оперативное лечение амебом матки, простаты, молочных желез и полипов кишечника. В случае язвенного поражения сигмовидной и прямой кишки необходимо начинать лечения больного с консервативного лечения, до полного исчезновения трофозоитов-эритрофагов и цист в анализах кала, и соскобов с пораженных поверхностей. Оперативное лечение рекомендуется проводить только по показаниям, в случаях возникновения кровотечения, перфораций, образования свищей.

Простота диагностики и не трудного мониторинга эффективности лечения больного, позволило сделать выводы-рекомендации по контролю амебиаза с раннего и до старческого возраста, а также беременным. В независимости от проживания пациента в Африке, Европе, Азии и других странах. В течение года необходимо трижды исследовать стул с периодичностью в 6 месяцев в целях выявления E.histolytica и проведение лечения до полного исчезновения цист из организма.

На основании проделанной работы можно сделать вывод, что Entamoeba histolytica представляет на сегодняшний день реальную опасность для здоровья и жизни наших пациентов. Вызывает ряд серьезных, трудно дифференцируемых от других заболеваний осложнений, это приводит к ошибочной диагностике и соответственно к неправильному лечению, особенно в таких областях медицины как гинекология, урология, онкология, гастроэнтерология, неврология и многих других.

Мы хотели бы рекомендовать врачам всех лечебных учреждений России обратить внимание на этот вид патологии. И при проведении профилактических осмотров обратить более тщательное внимание на состояние ЖКТ наших пациентов. Рекомендовать руководителям родильных домов и женских консультаций более тщательно проводить диспансеризацию женщин.

Эпидемиологам, необходимо разработать ряд международных программ по борьбе с Entamoeba histolytica. Военным врачам внимательно изучить эпидемиологию, клинику и патогенез заболевания, так как Entamoeba histolytica может быть использована как биологическое оружие, приводящее к женскому и возможно мужскому бесплодию, и большому количеству еще не изученных последствий поражения этим видом протозойной инфекции. Изучить и разработать методы обеззараживания воды, обработки продуктов питания. Продолжить разработку новых лекарственных препаратов и дезинфицирующих средств. Организовать массовую пропагандистскую компанию по борьбе с Entamoeba histolytica на уровне ВОЗ.

Литература

1. Свистунов О. П. Амебиаз и его клиническая картина в настоящее время. // Инфекционные заболевания. -2008. - №1. - С. 81-83

2. Амебиаз и борьба с ним. // Бюллетень ВОЗ - 1985, №3, с.1-9.

3. Павлова Е.А. Амебиаз. //ЦИУВ, Москва, 1980, 34 с.Руководство по тропическим болезням. Амебиаз. //Под ред. А.Я.Лысенко., 1983.

4.Gasparini, G., and Harris. A.L. (1995) J. Clin. Oncol, 13, 765-782.

5.Горбунова Ю.П. Лабораторная диагностика кишечных протозоозов. //ЦИУВ, Москва, 1989, 34 с.

6. Amebiasis DAVID A. BRUCKNER Department of Pathology and Laboratory Medicine, UCLA Medical Center, Los Angeles, California 90024-1713

7. Garcia, L. S., and D. A. Bruckner. 1988. Diagnostic medical parasitology. Elsevier Science Publishing Co. Inc., New York. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Oct. 1992, p. 356-369 0893-8512/92/040356-14$02.00/0 Copyright © 1992, American Society for Microbiology

8. Joyce, M. P., and J. I. Ravdin. 1988. Pathology of human amebiasis, p. 129-146. In J. I. Ravdin (ed.), Amebiasis: human infection by Entamoeba histolytica. John Wiley & Sons, Inc., New York.

9. Kapoor, 0. P., B. N. Nathwani, and V. R. Joshi. 1972. Amoebic peritonitis: a study of 73 cases. J. Trop. Med. Hyg. 75:11-15.

10. Kean, B. H., K. E. Mott, and A. J. Russell. 1978. Tropical

11. Weinke, T., B. Friedrich-Janicke, P. Hopp, and K. Janitschke. 1990. Prevalence and clinical importance of Entamoeba histolytica in two high-risk groups: travelers returning from the tropics and male homosexuals. J. Infect. Dis. 161:1029-1031.

12. Sargeaunt, P. G., J. E. Williams, J. Kumate, and E. Jimenez.1980. The epidemiology of Entamoeba histolytica in Mexico City. A pilot survey. I. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 74:653-656.

13. Amebiasis* Kerrison Juniper, Jr., M.D.** Phil J Microbiol Infect Dis 1984; 13(1):49-64

14. Scragg J. Amoebic liver abscess in African children. Arch Dis Child 1960; 35:171.

15. Reddy DG, Rangam CM. Amoebic granuloma (amoeboma) of the large intestine. Indian Med Gaz 1946; 81: 463.

16. Baker K, Zhang Y, Jin C, et al. Proximal versus distal hyperplastic polyps of the colo-rectum: different lesions or a biological spectrum? J Clin Pathol 2004;57:1089–1093

17. Goldstein N. Small colonic microsatellite unstable adenocarcinomas and high-grade epithelial dysplasia in sessile serrated adenoma. Am J Clin Pathol 2006;125:132–145

18. Kudo S, Lambert R, Allen JI, et al. Non-polypoid neoplastic lesions of the colorectal mucosa. Gastrointest Endosc 2008;68(4 Suppl):3–47

19. Oka S, Tanaka S, Hiyama T, et al. Clinicopathologic and endoscopic features of colorectal serrated adenoma: differences between polypoid and superficial types. Gastrointest Endosc 2004;59:213–219

20.Gasparini.G,and Harris.A.L.(1995)

21.Pluda,J.M., and Parkinson,D.R.(1995)

22. http://medbiol.ru/medbiol/phys_m/00006759.htm#00006b91.htm