Данная информация предназначена для специалистов в области здравоохранения и фармацевтики. Пациенты не должны использовать эту информацию в качестве медицинских советов или рекомендаций.
Экспертиза биологически активных добавок и лекарственных препаратов для
зрения. Определение качественного и количественного состава антоцианиновых
пигментов
Д.х.н. Готтих М.Б., Ташлицкий В.Н.
НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ
Введение
Антоцианозиды и флавоноиды, содержащиеся в листьях и плодах черники(Vaccinium
myrtillus), благодаря их выраженному антиоксидантному и сосудопротекторному
действию, представляют для офтальмологов особый интерес [1].
По данным различных авторов, антоцианозиды черники способствуют улучшению
реологических свойств крови, поскольку снижают тонус сосудистой стенки и
способствуют ее укреплению (эффект обусловлен участием данных веществ в
регуляции биосинтеза коллагена), уменьшают тромбообразование, а также ускоряют
регенерацию обесцвеченного родопсина - светочувствительного пигмента сетчатки.
Ускорение регенерации родопсина и активация ферментов сетчатки под влиянием
экстракта черники улучшают ночное зрение, снижают риск развития дистрофии
сетчатки, ускоряют процесс восстановления зрения после длительных зрительных
нагрузок [2,8]. За счет положительного влияния на синтез фосфолипидов клеточных
мембран, антоцианозиды черники уменьшают хрупкость капилляров, восстанавливают
их проходимость при сосудистых расстройствах (тромбозах), что способствует
улучшению трофики сетчатки глаза.
Кроме того, антоцианозиды и флавоноиды черники подавляют
патологическую альдозо-редуктазную активность в тканях хрусталика и
предупреждают развитие катаракты [3].
Антоцианозиды являются основными действующими на зрение веществами
черники. Они представляют из себя соединения антоцианинов с углеводами
(гликозиды) [4]. Это состояние обеспечивает их устойчивость к свету и действию
ферментов, а кроме того - в форме гликозидов улучшается растворимость пигментов
в клеточном соке [5]. Гликозиды из состава антоцианозидов не проходят через
клеточную мембрану, поэтому основу фармакологической активности экстрактов
составляют именно антоцианины [6]. Эффективность антоцианинов доказана в ряде
исследований [7].
В настоящее время в России зарегистрированы несколько пищевых добавок и
лекарственных препаратов офтальмологического профиля, содержащих экстракты
черники. Поскольку польза препаратов с черникой напрямую зависит от концентрации
антоцианинов в них, нами была проведена экспертиза биологически активных
добавок и лекарственных препаратов для зрения с целью определения качественного
и количественного состава. Для анализа мы использовали высокоэффективную
жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и рН-дифференциальную УФ-спектрофотометрию.
Цель исследования: определение количественного и качественного содержания
антоциановых пигментов черники в пяти образцах следующих препаратов: «Фокус»
(производитель АКВИОН, Россия), «Витрум вижн форте» (производитель
Unipharm Inc, США),
«Черника-форте» (производитель Эвалар, Россия), «Окулист» (производитель ДИОД,
Россия), «Стрикс» (производитель Ferrosan, Дания).
Материалы и методы исследования:
Для исследований в аптеках и аптечных пунктах были закуплены пять образцов
биологически активных добавок для глаз, в состав которых входит черника: «Витрум
вижн форте», «Фокус», «Стрикс», «Окулист», «Черника-форте».
В работе данные образцы были зашифрованы следующим образом:
| Препарат |
№ |
| «Фокус» (АКВИОН, Россия) |
1 |
| «Витрум вижн форте» (Unipharm Inc, США) |
2 |
| «Черника-форте» (Эвалар, Россия) |
3 |
| «Окулист» (ДИОД, Россия) |
4 |
| «Стрикс» (Ferrosan, Дания) |
5 |
Подготовка образцов для исследования:
Антоцианины из образцов экстрагировали дистиллированной водой из расчета
содержания антоцианинов 0,05–0,2 мг/мл [9]. Для этого таблетка или содержимое
капсулы тщательно измельчались в агатовой ступке. Для экстракции соответствующая
навеска порошка каждого образца помещалась в пластиковую пробирку объемом 50 мл
и добавлялся рассчитанный объем дистиллированной воды (от 10 до 50 мл в
зависимости от навески и образца) для получения растворов с концентрацией 2,0;
4,0; 5,0; 2,0 и 2,0 мг/мл для образцов 1–5 соответственно. Для ВЭЖХ исследования
были приготовлены растворы с большей концентрацией – 20,0 мг/мл; 40,0; 50,0;
20,0 и 20,0 мг/мл для образцов 1–5 соответственно. Экстракция проводилась при
непрерывном перемешивании на термошейкере C24KC
Refrigerated incubator
shaker Edison,
NJ, USA, при 160 об./мин,
температуре 37 оС, в течение 30 мин. Из полученных растворов
отбирались аликвоты объемом 1 мл, которые центрифугировали 10 мин при 14 000
об./мин, фильтровали через Millex-GV13,
0,22 um, 13 mm
Filter Unit,
MILLIPORE и хранили при –10 оС.
Определение суммарного содержания антоцианиновых пигментов методом
рН-дифференциальной спектрофотометрии.
Для метода рН-дифференциальной спектрофотометрии были использованы буферные
растворы № 1 и № 2:
Раствор № 1: рН 1 – 4,05 мг КСl, 1,238 мл конц.
НСl в 100 мл воды.
Раствор № 2: рН 4,5 – 1,64 г натрия ацетата в 100 мл воды и НСl
до рН 4,5.
К 0,96 мл буферного раствора № 1 или № 2 добавляли 40 мкл экстракта,
приготовленного как описано выше, и определяли оптическую плотность при 510 нм и
700 нм с соответствующим буфером в качестве раствора сравнения. Использовали
УФ-спектрофотометр Cary 50bio
производства Varian (США). Для каждого образца
эксперимент проводили дважды.
Суммарное содержание антоцианиновых пигментов рассчитывали по формуле [7]:
С (Σантоцианин, масс. %) = 100 %Ч[(А510рН1– А700рН1) –
(А510 рН4,5 – А700рН4,5)] Ч MW Ч
F/(ε Ч l
Ч C),
где:
ε и MW – коэффициенты молярного поглощения и
молекулярная масса антоцианина, используемого в качестве стандарта (для
цианидин-3-глюкозида 26 900 и 449,2 соответственно);
F = 25 – коэффициент разведения;
l =1 – длина оптического пути кюветы, см;
C – концентрация приготовленного раствора образца, г/л.
Определение качественного состава антоцианиновых пигментов методом ВЭЖХ
Качественный состав антоцианиновых пигментов определялся методом
обращеннофазной ВЭЖХ на колонке Gemini C18(2) 4,6Ч150
mm (5um) производства Phenomenex (США). Использовалось градиентное элюирование с
подвижной фазой А (0,151 % раствор трифторуксусной кислоты в воде) и подвижной
фазой В (0,151 % раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле) по программе
5–40 % В за 11 мин при скорости потока 1,5 мл/мин, температуре 25 °С, с
УФ-детекцией при 520 нм и УФ-спектральными данными от 230 до 800 нм. Был
использован хроматограф Agilent1100, состоящий из
четырехканального градиентного насоса с дегазатором, автосамплера, термостата и
диодно-матричного детектора. Сбор и обработка хроматограмм осуществлялась с
помощью программ «ChemStation B.01.03»
и «ACD/SpecManager 12.01».
Для ВЭЖХ-анализа образцов № 1, 4, 5 с концентрацией 20 мг/мл использовалась
аликвота 1 мкл, а для образцов № 2, 3 с концентрацией 40 и 50 мг/мл – аликвота
10 мкл.
Результаты исследования и их обсуждение
С помощью УФ-спектрометрического анализа было исследовано суммарное
содержание антоцианиновых пигментов во всех образцах. Полученные данные
приведены на рис. 1 и в таблице 1.
Рис. 1. Примеры спектров поглощения растворов образцов при рН 1.0 (А) и 4,5
(Б), где 0 – базовая линия, 1–5 – образцы № 1–5
Таблица 1. Расчет среднего содержания суммы антоцианиновых пигментов в
образцах № 1–5 методом рН-дифференциальной спектрофотометрии
| № образца |
C
образца, г/л |
А510 рН 1 |
А700 рН 1 |
А510 рН 4,5 |
А700 рН 4,5 |
Суммарная концентрация
антоцианиновых пигментов, % |
Масса капсулы (таблетки), г |
Масса пустой капсулы |
Масса суммы антоцианиновых
пигментов в капсуле (таблетке), мг |
Заявленная масса антоцианов, мг |
| 1 |
2 |
0,2606 |
0,0046 |
0,0587 |
0,0051 |
4,225 |
0,382 |
0,0958 |
12,09 ±
0,97 |
12,5 |
| 2 |
4 |
0,0038 |
0 |
0,0031 |
0,0006 |
0,014 |
0,833 |
0 |
0,11 ±
0,009 |
- |
| 3 |
5 |
0,022 |
–0,0002 |
0,0025 |
0,0004 |
0,168 |
0,2545 |
0 |
0,43 ±
0,034 |
- |
| 4 |
2 |
0,0912 |
0,0001 |
0,0129 |
0,0011 |
1,655 |
0,3819 |
0,0731 |
5,11 ±
0,41 |
10 |
| 5 |
2 |
0,1035 |
–0,0001 |
0,0103 |
0,0009 |
1,966 |
0,459 |
0 |
9,03 ±
0,72 |
- |
Как видно из полученных данных, все анализируемые образцы содержат
антоцианиновые пигменты, однако их концентрация в разных образцах варьируется в
широком диапазоне от 0,01 до 4,2 %, а содержание в одной таблетке или капсуле от
0,1 мг до 12,1 мг.
Для определения качественного состава образцов использовался метод
обращеннофазной ВЭЖХ. Полученные результаты приведены на рис. 2. Отнесение пиков
проводилось на основании времен удерживания и соотношения площадей. Времена
удерживания и соответствующие площади пиков приведены в таблице 2. Как видно из
хроматограмм и таблицы 2, качественный состав и соотношение компонентов всех
исследованных образцов, кроме образца № 2, практически одинаковы (в пределах
погрешности метода определения площади плохо разрешенных пиков) и соответствуют
литературным данным для экстрактов черники [7]. Хроматографический профиль
образца № 2 не соответствует антоцианиновым пигментам черники и, очевидно, имеет
другой источник.
Рис. 2. Примеры хроматограмм экстрактов образцов № 1–5, полученные
градиентным методом оф-ВЭЖХ с детекцией при 520 нм
Таблица 2. Средние времена удерживания и площади хроматографических пиков,
полученных при ВЭЖХ-анализе образцов № 1–5
v – объем аликвоты раствора образца, использованной для анализа;
C – концентрация раствора образца.
Выводы
На основании полученных данных (качественный анализ методом оф-ВЭЖХ) можно
утверждать, что все исследованные образцы препаратов, кроме «Витрум вижн форте»
(Unipharm Inc, США),
действительно содержат антоцианиновые пигменты из экстрактов черники, а не из
других природных источников. Препарат «Витрум вижн форте» (Unipharm
Inc, США) содержит небольшое количество антоцианиновых
пигментов из другого источника. Кроме того, количественное содержание этих
соединений, определенное методом рН-дифференциальной спектрофотометрии,
варьируется в широком диапазоне. В исследованных нами пищевых добавках и
лекарственных препаратах офтальмологического профиля содержатся антоцианиновые
пигменты из экстрактов черники (и другого источника) в следующем количестве
(препараты расположены в порядке убывания):
| Препарат |
Содержание антоцианов черники в таблетке
(капсуле), мг |
| «Фокус» (АКВИОН, Россия) |
12,09 |
| «Стрикс» (Ferrosan, Дания) |
9,03 |
| «Окулист» (ДИОД, Россия) |
5,11 |
| «Черника-форте» (Эвалар, Россия) |
0,43 |
| «Витрум вижн форте» (Unipharm Inc, США) |
0,11 |
Литература
- Ставицкая, Т.В. Применение экстракта черники в
офтальмологии / Клиническая офтальмология.- 2002. - Т. 3. - № 2. - С. 86-88.
- Nakaishi H., Matsumoto H., Tominaga S., Hirayama M. Altern Med Rev 2000;
5(6): 553–562.
- Bravetti G., Ann Ottalmol Clin Ocul, 1989, 115, p. 109-111.
- Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия: Учебник. – 4-е
изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 2002. – 656 с.
- Schmitt E., Stopper H. Nutrition and cancer 2001; 41 (1&2): 145–149.
- Camire M. Bilberries and Blueberries as Functional Foods and
Nutraceuticals. / Lancaster, Pa:Technomic Publishing Co Inc; 2000.
- Егоров Е.А., Романенко И.А. Современные аспекты патогенеза, диагностики,
клиники и лечения возрастной макулярной дегенерации. – Офтальмология. – № 1. –
2009.
- Head K.A. Altern Med Rev 2001; 2: 141–166.
- Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически
активных добавок к пище. МИНЗДРАВ РОССИИ. – Москва, 2004. – С. 106.
Главная
Реклама
Информация по теме