Данная информация предназначена для специалистов в области здравоохранения и фармацевтики. Пациенты не должны использовать эту информацию в качестве медицинских советов или рекомендаций.
Оптимизация диагностических подходов в тактике ведения
больных гриппом
Н. Д. Ющук*, доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН
Н. О. Бокова*
О. О. Знойко*, доктор медицинских наук, профессор
К. Р. Дудина*, доктор медицинских наук
Г. Н. Кареткина*, кандидат медицинских наук, доцент
Е. А. Климова*, доктор медицинских наук, профессор
М. Г. Кулагина*, кандидат медицинских наук, доцент
В. И. Каширин**
О. А. Филиппова**
О. А. Сафонова**
В. Е. Маликов**, кандидат медицинских наук
*ГБОУ ВПО МГМСУ им. А. И. Евдокимова Минздравсоцразвития России,
**ГКУЗ ИКБ № 1 Департамента здравоохранения города, Москва
Грипп занимает одно из ведущих мест в структуре инфекционной патологии
человека. Во всех странах мира основной экономический ущерб от инфекционных
заболеваний наносят именно грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ).
В России на их долю приходится примерно 90% всей регистрируемой инфекционной
заболеваемости. По данным официальной статистики в РФ ежегодно регистрируется от
900 тысяч до 3,5 млн случаев гриппа, при этом умирает от 20 до 53 тысяч человек
в год [1].
Заболеваемость гриппом существенно колеблется в разное время года,
увеличиваясь, как правило, в осенне-зимнее время. Тем не менее, случаи гриппа
могут регистрироваться даже в межэпидемический период. История изучения гриппа
уходит своими корнями еще в средние века. Первая эпидемия, о которой мы знаем,
имела место в 1889–1890 гг. и была вызвана подтипом вируса гриппа А (H2N8) [2].
Благодаря уникальным свойствам вируса гриппа А и прежде всего его способности к
изменению антигенной структуры, специфический иммунитет, приобретенный после
перенесенного заболевания, практически не защищает от инфицирования новым
штаммом вируса гриппа. Во время ежегодных вспышек и эпидемий гриппа и других
ОРВИ заболевает каждый 10-й взрослый и каждый 3-й ребенок [3]. По данным ВОЗ, во
время сезонных эпидемий, вызванных различными вирусами гриппа, в мире ежегодно
умирают от 250 до 500 тысяч (большинство из них в возрасте старше 65 лет),
причем в некоторые годы число смертей может достигать миллиона [4]. Пандемии
гриппа возникают каждые 30–40 лет и характеризуются высокими показателями
заболеваемости и смертности [5].
В настоящее время существуют различные противовирусные препараты для лечения
гриппа. Их можно разделить на три группы: этиотропные — ингибиторы нейраминидазы
(осельтамивир, занамивир, перамивир), блокатор ионного канала, образованного
белком М2 (Ремантадин, Альгирем), ингибиторы NP-белка (Ингавирин), ингибитор
гемагглютинина (Арбидол); препараты интерферона (рекомбинантные альфа/гамма-интерфероны);
индукторы интерферонов (Кагоцел, Амиксин, Циклоферон). Наиболее эффективна
противовирусная терапия, начатая в первые 24–48 часов от начала заболевания,
которая позволяет существенно сократить продолжительность лихорадки и других
клинических симптомов заболевания [6].
Именно поэтому необходимость точной и своевременной диагностики гриппа не
вызывает сомнений. На сегодняшний день в клинической практике чаще всего
используется метод прямой иммунофлуоресценции (ИФ) и, намного реже, метод
полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Как известно, метод ИФ предложил А. Кунс еще в 1941 г. Реакция ИФ основана на
связывании антигена с антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой (флуорохромом,
например, флюоресцеина изотиоционатом (FITС), тетраметилродамин изотиоционатом (TRITC)
и др.). Сегодня для проведения этой реакции используют как поликлональные
сыворотки, так и моноклональные антитела. Учет результатов реакции
осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему
которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата
ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длиной волны [7].
Метод ПЦР был разработан сотрудником фирмы Cetus K. Mullis в 1983 г.
Существуют различные модификации этой реакции. В настоящее время используют ПЦР
с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР), суть которой
заключается в амплификации определенных участков ДНК в процессе повторяющихся
температурных циклов [8, 9].
Настоящее исследование посвящено сравнительному анализу диагностического
значения методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР с целью оптимизации диагностических подходов
в тактике ведения больных острыми респираторными заболеваниями и гриппом.
Материалы и методы
Всего в исследование включен 81 мужчина и 59 женщин (140 пациентов),
поступавших в отделения острых респираторных вирусных инфекций ГКУЗ ИКБ № 1
Департамента здравоохранения г. Москвы в состоянии средней тяжести с
направительным диагнозом: «ОРВИ» либо «Грипп». Средний возраст больных — 35,5 ±
1,6 года (от 15 до 87 лет). Критериями включения пациентов в исследование были:
наличие симптомов гриппа и ОРВИ (повышение температуры тела, симптомы
интоксикации и катарального воспаления дыхательных путей); обследование двумя
методами для подтверждения гриппа (прямая ИФ и ПЦР) в первые двое суток от
момента поступления больного в стационар. При этом материал, взятый от больного
для проведения этих исследований, должен был содержать достаточное количество
клеток эпителия носоглотки для анализа. Критериями исключения из исследования
были: наличие хронической обструктивной болезни легких, беременность.
Всем пациентам, включенным в исследование, проводилось стандартное
общеклиническое обследование: сбор анамнеза заболевания, объективный осмотр,
анализ клинической картины в сопоставлении с данными
лабораторно-инструментальных методов исследования (общие анализы крови и мочи,
рентгенологическое исследование органов грудной клетки). Для оценки степени
дыхательной недостаточности больным проводилась пульсоксиметрия. При наличии у
пациента пневмонии по данным рентгенологического исследования органов грудной
клетки дополнительно назначался биохимический анализ крови (определение уровней
аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), мочевины,
креатинина, креатининфосфокиназы), а также анализ крови для оценки
кислотно-основного состояния и электролитов.
Молекулярно-генетическое исследование осуществлялось при помощи ОТ-ПЦР с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации для выявления
генетического материала вирусов гриппа А (сезонного), гриппа А (H1N1) pdm09,
гриппа В в эпителии носоглотки/ротоглотки при помощи тест-систем «АмплиСенс®» с
аналитической чувствительностью — 1000 микроорганизмов в 1 мл биологического
материала.
Иммунологическое исследование выполнялось при помощи метода прямой ИФ.
Диагностикум представляет собой специфические моноклональные антитела
(иммуноглобулины), меченые флуоресцеинизотиоцианатом. В работе использовались
серии диагностикумов производства ФГБУ НИИ гриппа (г. Санкт-Петербург), рабочее
разведение диагностикумов было не ниже 1:16. Анализ мазков-отпечатков из
носоглотки проводился с помощью люминесцентного микроскопа «Биомед-6» (Россия).
Результаты
Для проведения сравнительного анализа методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР группа
больных (n = 140), в которой были применены одновременно эти две методики с
целью уточнения этиологии основного заболевания, была разделена на три
подгруппы: 1-я подгруппа — пациенты, у которых диагностика гриппа двумя
методиками проводились в один день; 2-я подгруппа — пациенты, которым ПЦР было
выполнено раньше метода ИФ на 1–2 суток; 3-я подгруппа — пациенты, которым метод
прямой ИФ был проведен раньше ПЦР на 1–2 суток. Результаты исследования эпителия
носоглотки методами прямой ИФ и ОТ-ПЦР у 140 больных, включенных в исследование,
представлены в табл. 1–3.
Выполнено сравнение частоты регистрации четырех комбинаций (профилей)
результатов тестов прямой ИФ и ОТ-ПЦР: ИФ«+»/ПЦР«+», ИФ«-»/ПЦР«+», ИФ«+»/ПЦР«-»,
ИФ«-»/ПЦР«-».
При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе
пациентов (n = 20), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в
один день и в первые 3 дня от начала заболевания, частота выявления профиля
ИФ«-»/ПЦР«+» была самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления
профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0005 и p = 0,0019 соответственно).
При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе
пациентов (n = 37), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в
один день и на 4–5 сутки от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+»
была также самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей
ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0001 и p = 0,0001 соответственно).
При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе
пациентов (n = 11), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в
один день и позже 5 суток от начала заболевания, частота выявления профиля
ИФ«-»/ПЦР«+» была также самой высокой, но достоверно отличалась только от
частоты выявления профиля ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0078), в то время как достоверной
разницы с частотой выявления профиля ИФ«+»/ПЦР«+» не выявлено (p = 0,0868).
Как видно из табл. 1, в группе больных (n = 20), которым ОТ-ПЦР и
исследование методом прямой ИФ проводили в один день и в первые 3 дня от начала
заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у 17 (85%)
пациентов, при этом большая часть (82%, 14/17) положительных результатов
получена при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований
методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось только в 11,8% (2/17) случаев, в то
время как в 70,6% (12/17) случаев методом прямой ИФ антигены вируса гриппа
выявить не удалось.
В группе больных, которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в
один день и на 4–5 сутки от начала заболевания, грипп был лабораторно
подтвержден тем или иным методом у 28 (75,7%) пациентов, при этом большая часть
положительных результатов (92,9%, 26/28) также была получена при использовании
метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР
регистрировалось в 10,7% (3/28) случаев, а в 82,1% (23/28) выявить антигены
вируса гриппа методом прямой ИФ не удалось.
В группе больных (n = 11), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ
проводили в один день и позже 5 суток от начала заболевания, грипп был
лабораторно подтвержден тем или иным методом у всех пациентов. При использовании
метода ОТ-ПЦР этиология была установлена у 90,9% (10/11) больных, совпадение
результатов двух методик регистрировалось в 3 (27,3%) случаях.
При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе
пациентов (n = 11), которым исследование ОТ-ПЦР было выполнено на 1–2 дня раньше
прямой ИФ и в 1–3 дня от начала болезни, грипп был подтвержден у 9 пациентов, и
только методом ОТ-ПЦР в 100% случаев (профиль ИФ«-»/ПЦР«+»).
При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе
пациентов (n = 40), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом
прямой ИФ на 1–2 дня и на 4–5 сутки от начала заболевания, частота выявления
профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была самой высокой и достоверно отличалась от частоты
выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0001 и p = 0,0001
соответственно).
При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе
пациентов (n = 18), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом
прямой ИФ на 1–2 дня и позже 5 суток от начала заболевания, частота выявления
профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была также самой высокой и достоверно отличалась от частоты
выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0006 и p = 0,0002
соответственно).
Как видно из табл. 2, в группе пациентов (n = 11), которым ОТ-ПЦР было
проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и на 1–3 сутки от
начала заболевания, при помощи последнего выявить антигены вируса гриппа не
удалось ни у одного пациента, в то время как при использовании метода ОТ-ПЦР
генетический материал вируса гриппа был выявлен у 9 (81,8%) больных.
В группе больных (n = 39), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования
методом прямой ИФ на 1–2 дня и на 4–5 сутки от момента заболевания, грипп был
лабораторно подтвержден тем или иным методом в 76,9% случаев, при этом
большинство положительных результатов (90%, 27/30) получено при использовании
метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР
регистрировалось лишь в 4 (13,3%) случаях.
В группе пациентов (n = 18), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше
исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и позже 5 суток от начала заболевания,
грипп лабораторно подтвержден тем или иным методом у 77,8% (14/17) больных, при
этом большинство положительных результатов также было получено при использовании
метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР
регистрировалось в 14,3% (2/14) случаев.
В табл. 3 представлены результаты пациентов, у которых исследование методом
прямой ИФ было сделано раньше ОТ-ПЦР и обследованных позже 3-го дня болезни. Из
трех пациентов, обследованных на 4-й день и позже, грипп был подтвержден в 100%
случаев только методом ОТ-ПЦР (профиль ИФ«-»/ПЦР«+»).
В целом, среди всех обследованных, независимо от дня болезни, на который
выполнялось исследование, были пациенты (n = 10), у которых при помощи метода
прямой ИФ выявлялись антигены вируса гриппа, в то время как методом ОТ-ПЦР
выделить генетический материал вируса не удавалось (профиль ИФ«+»/ПЦР«-»). Такое
расхождение результатов обследования наблюдалось в 7,1–17,6% случаев, не
прослеживалось связи указанного профиля с днем болезни, на который проводилось
обследование, однако в группе больных, у которых обследование методом прямой ИФ
применялось раньше ОТ-ПЦР, таких пациентов не было.
Обсуждение
Среди всех больных с диагностированным гриппом доля положительных результатов
ОТ-ПЦР-исследования составляет от 77,8% до 100%. При этом основную группу
(78,9%, 90/114) составили пациенты, у которых методом ОТ-ПЦР был выявлен
генетический материал вируса гриппа, в то время как антигены вируса гриппа при
проведении прямой ИФ идентифицировать не удавалось. Доля
лабораторно-подтвержденных случаев гриппа методом прямой ИФ (среди всех
подтвержденных случаев как методом прямой ИФ, так и ОТ-ПЦР) составила 21,1%.
Полученные результаты свидетельствуют о больших диагностических возможностях
метода ОТ-ПЦР у больных гриппом, и что немаловажно, независимо от дня болезни
при наличии клинической картины острого заболевания.
Меньшие диагностические возможности метода прямой ИФ объясняются самим
механизмом реакции. Антитела взаимодействуют с антигеном в местах их
локализации. Эти места выявляют при помощи метки, связанной с антителами. Это
наиболее простой метод визуализации, однако чувствительность его крайне низкая,
так как на одну молекулу искомого антигена будет приходиться одно меченое
антитело [7]. Достоинством метода ОТ-ПЦР является необязательность условия
наличия большого количества возбудителя в клетках эпителия, так как сам метод
предусматривает увеличение количества копий ДНК/РНК возбудителя (амплификация) с
последующей его детекцией [8, 9]. Так как оба метода используются
преимущественно для ранней диагностики гриппа, что принципиально для
своевременного назначения противовирусной терапии, то, безусловно, клиницист
отдаст свое предпочтение тому методу, который позволяет это сделать с наибольшей
вероятностью.
Также необходимо учитывать, что большая разница в частоте лабораторного
подтверждения гриппа, свидетельствующая о низкой диагностической возможности
метода прямой ИФ, может быть объяснена вероятностью перекрестных реакций,
быстрым разрушением флуоресцентной метки, субъективностью оценки результатов
реакции. Последний фактор зависит непосредственно от квалификации
врача-лаборанта, проводящего исследование. Помимо этого проведение прямой ИФ —
весьма трудоемкий неавтоматизированный процесс, требующий больших временных
затрат от специалиста. По сравнению с методом прямой ИФ ОТ-ПЦР является
автоматизированным высокочувствительным методом, дающим возможность выявлять
даже единичные копии ДНК/РНК возбудителя на поздних сроках от начала
заболевания. ОТ-ПЦР обладает высокой специфичностью, что обусловлено
определением участка гена, характерного только для данного возбудителя.
Выводы
- Для ранней диагностики гриппа большую диагностическую ценность
демонстрирует метод ОТ-ПЦР по сравнению с методом прямой ИФ.
- Для оптимизации лечебной тактики ведения больных c гриппом целесообразно
широкое внедрение метода ОТ-ПЦР в клиническую практику.
- Оптимальные сроки обследования — первые 5 дней болезни, однако при наличии
клинической симптоматики гриппа метод ОТ-ПЦР информативен и на более поздних
сроках заболевания.
Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для
государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (протокол №
1 от 19 марта 2010 г.) по соглашению № 16.120.11.5354-НШ от 01.02.2012 г.
Литература
- Салтыкова Т. С. Заболеваемость гриппом и отсроченная смертность у
лиц старше 60 лет. Автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 2010.
- http://www.epidemiolog.ru/all_of_diseases/detail.php? ID = 2002901.
- http://www.omnipharm.ru/articles/71/page/17/.
- http://www.who.int/ru.
- Климова Е. А., Ющук Н. Д., Кареткина Г. Н. и др. Исходы тяжелого
течения пандемического гриппа А/H1N1/2009 // Терапевтический архив. 2010. №
11, с. 15–18.
- Петров В. И., Ленева И. А., Недогода С. В. Применение
отечественного противовирусного препарата с позиций доказательной медицины //
Лечащий Врач. 2011. № 1, с. 71–79.
- http://www.biovitrum.ru/presscenter/articles/razdel1/podrazdel2/istoriya_immunogistohimii.
- Теоретические основы полимеразной цепной реакции. Методическое пособие. «НПФ
ДНК-технология». М., 1998. http://www.twirpx.com/file/454057/.
- Heid C. A. Real-time quantitative PCR // Genome Res. 1996. № 6, p.
986–994.
- Екимов А. Н., Шипулин Г. А., Бочкарев Е. Г., Рюмин Д. В. Новейшие
технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time
PCR) // http://www.pcr.ru/images/artiogr/articles/article_18.htm.
Статья опубликована в журнале
Лечащий Врач