Масс-спектрометрия микробных маркеров и ее реализация в микробиологическом анализаторе «Маэстро»

Институт Аналитической Токсикологии

Цель. Продемонстрировать уникальные возможности применения метода масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) в клинической практике для одновременного детектирования широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов по химическим маркерам непосредственно в биологических средах организма человека.

Материалы и методы. Материалами для исследования могут быть любые объекты биологического (и не только) происхождения: кровь, слюна, моча, ликвор, синовиальная или асцитическая жидкость, мокрота, мазки из зева, носовых и слуховых проходов, секреты половых органов, биоптаты и экссудаты тканей, мазки и соскобы кожи. Количества образца на анализ: кровь 40 мкл; ликвор/слюна и другие жидкости 80 мкл; соединительная ткань/эпителий 4-8 мг; мышечная ткань 40 мг; моча 2 мл. Методический подход одинаков для всех типов образцов. Жидкие пробы требуют предварительного высушивания. Такие пробы как моча и, например, бронхоальвеолярный лаваж требуют предварительной концентрации. Пробы обрабатывают раствором HCl в метаноле концентрацией 1 моль/литр (400 мкл, 80ºС, 45 мин). Продукты кислого метанолиза экстрагируют гексаном (400 мкл) с добавлением 300 нг дейтерометилового эфира тридекановый кислоты в качестве внутреннего стандарта. Экстракт выушивают и дериватизируют N,О-бис-(триметилсилил)-трифторацетамидом (20 мкл, 80ºС, 5 мин). Реакционную смесь разбавляют 60 мкл гексана и в таком виде анализируют методом газовой хроматографии с последующим масс-спектрометрическим детектированием.

Результаты и обсуждение. Метод МСММ зарегистрирован Росздравнадзором в качестве новой медицинской технологии (Разрешение ФС № 2010/038 от 24 февраля 2010 года). Разработка не имеет аналогов в практике клинических бактериологических исследований. Метод внедрен в медицинских учреждениях ряда городов России от Санкт-Петербурга до Владивостока, имеющих собственное оборудование и обученный персонал. В Международном аналитическом центре метод используется с 2013г. и реализован в Микробиологическом анализаторе Маэстро.

Применяемые принципы анализа микробных сообществ в инфекционных процессах и при дисбиозах позволяет экспрессно (2 часа) и количественно оценивать изменение естественной микробиоты и микст-инфекции на превалирующем фоне биологической жидкости (чувствительность 103-104 клеток в пробе, селективность – до вида). Метод удобен для мониторинга заболевания, коррекции антибиотикотерапии, а также сопоставления состава микроорганизмов в разных органах человека по большому числу аэробных, анаэробных, медленно растущих бактерий, а также микроскопических грибов, актиномицетов и вирусов.

В одной пробе в рамках единого анализа одновременно определяется более 50 микроорганизмов. При этом анализ производится непосредственно в материале без высевания и подращивания и не требует биологических и биохимических тестовых материалов (культуральных сред, ферментов, субстратов, праймеров и т.п.). Технически это достигается путем периодического сканирования нескольких десятков ионов в режиме селективной регистрации. Выбираются ионы, специфичные для жирных кислот, оксикислот и стеролов, являющихся родовыми или видовыми маркерами клеточной стенки микроорганизмов.

Преимущества метода МСММ говорят об очевидной необходимости его популяризации и продвижения. Микробиологический анализатор Маэстро представляет собой готовое решение для работы по методике МСММ и включает: газовый хроматограф Маэстро с масс-селективным детектором и систему автоматической подачи проб, сконфигурированный в соответствие с требованиями методики, а также пакет программного обеспечения, содержащий программу управления прибором (все настройки заданы), программу анализа данных (с базой данных регистрируемых компонентов), программу формирования стандартизованного отчета (с базой данных по нормам микробной нагрузки в типичных образцах). Организация готового решения по принципу классического баканализатора (заданная «закрытая» конфигурация с четкой однозначной процедурой пробоподготовки и анализа) существенно упрощает внедрение метода МСММ в клиническую практику и превращает сложный, зачастую, для понимания лаборантам-биохимикам и микробиологам прибор физико-химического анализа в рутинный инструмент. Стандартизованная форма отчета, где данные приводятся в сравнение с нормой и/или с оценкой клинической значимости наблюдаемых цифровых значений, упрощает понимание результатов анализа.

Выводы. Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине, и лабораторные методы исследования зачастую играют ведущую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания. Применение в клинической практике современных диагностических инструментов безусловно способствует прогрессу в области здравоохранения в целом.

© Быстрова О.В., Веденин А.Н., Осипов Г.А.

Международный аналитический центр ООО «Интерлаб», Москва.

Научное издание Всероссийская научно-практическая конференция НОВЫЕ МЕТОДЫ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ В МЕДИЦИНЕ, ФАРМАЦИИ, ВЕТЕРИНАРИИ И ЭКОЛОГИИ. Под редакцией профессора В.Б. Сбойчакова и доктора медицинских наук В.В. Малышева