Глава III. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 69 белых беспородных крысах обоего пола, массой 150-200 г. Животные находились в пластмассовых клетках при температуре 18-20С, имели свободный доступ к пище и воде. В соответствии с целью и задачами работы при помощи морфо-гистологических методов было проведено изучение влияния антирабической вакцины на морфофункциональное состояние органов иммунной системы белых крыс:

− у нормально развивающихся животных в постнатальном онтогенезе (до 1 года);
− перенесших иммобилизационный стресс;
− в условиях моделирования экспериментального сепсиса;
− влияния ионизирующего облучения;
− исследован иммунный статус у 9 вакцинированных антирабической вакциной людей;
− проведен ретроспективный анализ медицинской документации людей, получивших полный курс антирабической вакцинации в 1990-1998 годах по поводу укуса животными.

Животных всех экспериментальных групп выводили из опытов путём декапитации после эфирного наркоза. Животные І группы (30) были выведены из опыта через 7, 14, 21, 90, 180, 360 суток после вакцинации. Каждая из 6 серий этой группы состояла из 5животных.

Животные ІІ группы (30) через 180 суток после вакцинации были разделены на 3 серии и подвергнуты экстремальным воздействиям: І серия (10)-
иммобилизационному стрессу; ІІ серия (10)- экспериментальному стафилококковому сепсису; ІІІ серия (10)- рентгеновскому облучению. Контрольная группа состояла из 9 животных. Иммобилизационный стресс у животных моделировали путем содержания их в течение 6 часов в клетках-пеналах [139, 140]. Моделирование стафилококкового сепсиса производили внутривенным введением культуры золотистого стафилококка, штамм 370, выделенного от больного человека. Заражающая доза 5*108микробных тел являлась летальной для животных контрольной группы.

Рентгеновское облучение животных проводили путем однократного тотального облучения в дозе 12 Гр на установке РУМ-17(180кВ, 10мА,0,64Гр/мин., фильтр 0,5мм Си, КФР-40 см). Летальность в контрольной группе составляла 100% в сроки от 3-х до 15-ти суток после облучения. Животным І и ІІ групп под эфирным наркозом производили перфузию кровеносной системы через брюшную аорту 5% раствором глюкозы и импрегнировали кровеносное и лимфатическое русло внутренних органов [61].

Для исследования использовали тимус, селезенку, большой сальник, брыжеечные лимфатические узлы и головной мозг. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине или 2,5% глютаровом альдегиде и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, азурІІ-эозином, по Ван Гизон и по Браше. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Документирование полученных данных производили на цветной фотопленке фотосъемкой на микроскопе МБИ-15. Электронное микроскопирование образцов проводили по методу [169]. Определение относительного и абсолютного количества лимфоцитов и лейкоцитов в периферической крови проводили по [66]. Для определения степени активации иммунной системы использовали модифицированный метод [131], разработанный для исследования крови человека. Метод позволяет судить о степени активации или депрессии иммунной системы по отношению суммы активированных и бластных форм лимфоцитов к количеству малых лимфоцитов.

Выделение мононуклеарных клеток проводили с помощью центрифугирования в растворе фикалла-верографина с плотностью 1,077г/см3в течение
30 минут. Из полученного концентрата готовили мазки, их окрашивали горячим красителем Гимза в течение 2-х минут, промывали проточной водой и исследовали под увеличением 900х. Из 100 обнаруженных лимфоцитов подсчитывали относительное количество малых, активированных, бластных и больших гранулярных лимфоцитов. При этом один лимфобласт приравнивался к пяти активированным лимфоцитам [10].

Индекс активации иммунной системы:

Иакт=(Лб+Ла/5)/Лм,

где Лб-бластные, Ла-активированные, Лм-малые лимфоциты. При активации иммунной системы в периферической крови появляются бластные и активированные лимфоциты и, следовательно, возрастает Иакт иммунной системы и наоборот.

Вычисление объемной плотности лимфоидных элементов в органах иммунной системы проводили по методике [3, 4] с помощью окулярной 100-точечной сетки. При этом подсчитывали количество точек, совпадающих с исследуемыми клетками. Количество точек, совпадающих с клетками, равно объемной плотности исследуемого объекта.

Вычисление индекса митотической активности проводили по способу, предложенному [10]. При этом на одном срезе иммунного органа учитывали от 3-х до 6-ти герминативных центров, в которых подсчитывали количество лимфоидных клеток с фигурами митоза. Отношение количества митозов к количеству исследованных лимфоидных узелков представляет собой индекс митотической активности данного иммунокомпетентного органа. Этот индекс отражает пролиферативную активность лимфоидных элементов герминативных центров. Он может снижаться до нуля при иммунодефицитных состояниях [124] и значительно повышается при антигенной стимуляции.

И мит: N митозов: N лимфоидных узелков.

Индекс миграционной активности определяли путем вычисления отношения суммарного количества лимфоцитов, находящихся в просвете посткапиллярных венул (ПКВ), с высоким эндотелием и числа лимфоцитов, адгезированных к их стенке к общему числу посткапиллярных венул на
данном срезе. Время рециркуляции при иммунодепрессии увеличивается [121], уменьшается количество мигрирующих лимфоцитов, следовательно, индекс миграции уменьшается, а при антигенной стимуляции имеет место обратный процесс.

Имигр=∑(N1+N2) : N3,

где N1- лимфоциты в просвете ПКВ; N2- лимфоциты адгезированные к стенке ПКВ; N3- общее число ПКВ на срезе.

Во всех группах животных исследовали морфо-функциональное состояние микроциркуляторного русла. Проводили морфометрию внутреннего диаметра всех его компонентов, рассчитывали их плотность на 1 мм2, степень деформации микрососудов, нарушение реологических свойств крови, проницаемости сосудистой стенки, количества редуцирующих и вновь образованных гемокапилляров.

Вычисляли М+δ(n-1), n=25; m+-δ; t=(M1-M2):

Далее по таблице определяли вероятность (Р) возможной ошибки. Различие принимали как достоверное при р<0,05. Коэффициент корелляции вычисляли по формуле: r=∑(x1*x2): γ. При этом 0,1<r<0,5- слабая связь между параметрами; 0,5<r<0,7- средняя степень корреляции; r>0,7- сильная связь между сравниваемыми группами [4].

Животных иммунизировали антирабической вакциной, производимой ИПВЭ им. М.П. Чумакова, созданной на основе культуры производственного штамма фиксированного вируса бешенства (Внуково-32). Вакцину вводили туберкулиновым шприцем троекратно в нулевой, 7-й и 30-й день по 0,2 мл внутримышечно в дельтовидную мышцу. С целью установления влияния антирабической вакцинации на возникновение заболеваемости у людей был проведен ретроспективный анализ медицинской документации 1708 лиц ранних возрастных групп, получивших антирабическую вакцинацию в 1990-1998 годах в связи с укусами собак, кошек, крыс.

Вакцинация проводилась в травматологических пунктах №2 и №3, а так же в антирабическом кабинете поликлиники №6 города Самары. При этом
использовали вакцину Ферми: укороченный курс –3 инъекции, полный курс – 6 инъекций внутрикожно. Обрабатывали следующую информацию:

- наличие основного заболевания: туберкулеза, новообразования, бронхиальной астма, коллагенозов, парадонтитов и парадонтозов, язв желудка;
- обращаемость за поликлинической помощью по поводу острых заболеваний (грипп, острая респираторная вирусная инфекция, герпетическое
поражение);
- смертность и ее причины.

Полный иммунный статус изучен у 9 лиц, вакцинированных в 1993-1998 годах по поводу укуса животными: у 3 лиц, вакцинированных в 1993 году (через 7 лет после вакцинации), у 3 лиц, вакцинированных в 1996 году (через 4 года после вакцинации) и у 3 лиц, вакцинированных в 1998 году (через 2 года после вакцинации).

В каждую группу входили лица одного возраста и пола: мужчины 32-35 лет. Критериями эффективности антирабической вакцины служили:

- стимулирующее влияние антирабической вакцинации на периферические органы иммунной системы, выражающиеся в гипертрофии лимфоидных узелков, формировании вторичных узелков, расширении герминативных зон, наличие в них большого количества антигенактивированных клеток;
- увеличение функциональной активности микроциркуляторного русла органов иммунной защиты, усиление транспортной активности эндотелия,
кровеносных и лимфатических микрососудов;
- уменьшение иммунодепрессивного действия стресса;
- усложнение создания модели сепсиса;
- снижение смертности экспериментальных животных после летальной дозы Rg-облучения;
- повышение неспецифической резистентности у привитых лиц к воз никновению ряда заболеваний по сравнению с контрольной группой людей,
не подвергшихся антирабической вакцинации.