4.2. Современные методы определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам

В связи с существенным расширением спектра возбудителей и нередко пересмотром роли некоторых из них в возникновении, развитии и распространении инфекций для практики все более актуальным становится вопрос о применении адекватных методов и средств выделения и точной идентификации возбудителя конкретного заболевания, а также адекватных средств этиотропной терапии и профилактики.

Успех классических методов обнаружения возбудителя инфекции зависит от правильного выбора вида и количества исследуемого материала, времени и техники его отбора, условий транспортирования, обработки, подбора методов и средств выделения и идентификации возбудителя. В каждом конкретном случае они определяются свойствами возбудителя, характером и стадией инфекции.

Получение корректных данных возможно только при грамотном выполнении всех звеньев бактериологического исследования:

• взятия клинического материала,
• транспортировки его в бактериологическую лабораторию,
• идентификации возбудителя до определения его чувствительности к антибиотикам
• интерпретации полученных результатов.

Вторая причина, обусловливающая необходимость определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам – это получение эпидемиологических данных о структуре резистентности возбудителей внебольничных и нозокомиальных инфекций.

В практике эти данные используют при эмпирическом назначении антибиотиков, а также для формирования больничных формуляров.

Однако необходимо отметить, что несмотря на постоянное совершенствование технологий и внедрение в рутинную практику новых, более чувствительных и специфичных методов идентификации микроорганизмов, классические правила забора клинического материала остаются неизменными.

К ним относятся:

• правильный выбор соответствующего образца для исследования (например, недопустимо использование мазков из зева для определения возбудителя пневмонии);
• оценка риск/польза для пациента при выборе соответствующего метода забора материала (например, использование надлобковой пункции мочевого пузыря требуется очень небольшой группе пациентов);
• проведение забора материала до начала антимикробной терапии (при заборе образца после её начала микробиологическое исследование часто даёт отрицательный результат);
• доставка материала в лабораторию в возможно короткие сроки (в целом, не позднее 2　ч после забора) в соответствующих транспортных контейнерах и при определённом температурном режиме. (Исключением является использование специальных транспортных сред, когда сроки доставки могут увеличиваться до 24　ч.)

Чаще всего провести идентификацию возбудителя до начала антимикробной терапии не представляется возможным. В таких случаях использование так называемой "бактериологической статистики" является чрезвычайно важным. Данный термин подразумевает использование общепринятых представлений о микроорганизмах, которые являются наиболее вероятными возбудителями инфекции в подобной клинической ситуации. Так, например, у пациента с нормальным иммунитетом, у которого развился целлюлит руки после небольшой царапины, наиболее вероятными возбудителями являются Staphylococcus aureus или Streptococcus pyogenes. На основании этих данных можно выбрать соответствующую терапию даже при отсутствии адекватного клинического материала, например, для окраски по Граму.

Вследствие того, что микроорганизмы обладают различной чувствительностью к АМП, становится очевидным, зачем следует проводить данное исследование. Независимо от выбранных методов определения чувствительности, описание которых представлено ниже, первоначально следует выделить микроорганизм в "чистой культуре".

В настоящее время широко используются не только классические полуколичественный (диско-диффузионный) и количественные методы (разведения в агаре или бульоне), но и современные (Е-тесты, автоматические анализаторы, молекулярно-генетические) методы определения чувствительности.

Использование стандартных бумажных дисков, импрегнированных АМП, является наиболее распространённым в большинстве лабораторий. Принцип метода заключается: на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 по McFarland) и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика (рис. 4.1).

Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 35^о-37^оС в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах. Затем по специальным интерпретационным таблицам (в зависимости от диаметра зон подавления роста) проводится классификация возбудителей по степени чувствительности на чувствительные, умеренно-резистентные и резистентные.

Этот метод относят к полуколичественному, так как он позволяет лишь в определённой степени прогнозировать клиническую эффективность исследуемого препарата.

Методы разведения в плотных (агаровых) и жидких (бульонах) питательных средах, а также их модификации (методы микроразведения) являются количественными и позволяют с большой долей вероятности прогнозировать клиническую эффективность препаратов.

Они позволяют определить минимальную подавляющую концентрацию (МПК), т.е. минимальную концентрацию АМП, при которой подавляется видимый рост микроорганизмов после 18-24-часового периода инкубации. С помощью этих методов (при высеве из пробирок (или чашек) с отсутствием роста) можно определить также минимальную бактерицидную концентрацию (МБК), т.е. минимальную концентрацию АМП, приводящую к гибели 99,9% микроорганизмов.

Методы разведения основаны на использовании двойных последовательных разведений концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (например от 128　мкг/мл, 64　мкг/мл, и т.д. до 0,5　мкг/мл, 0,25　мкг/мл и 0,125　мкг/мл) (рис. 4.2).

1. Антибиотик в различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон) или в агар.
2. Затем бактериальную суспензию определенной плотности, соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, помещают в бульон с антибиотиком или на поверхность агара в чашке.
3. После инкубации в течение ночи при температуре 35^о-37^оС проводят учет полученных результатов.

Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается.

Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл.

Кроме данного показателя иногда определяют показатель МБК.

Значение МБК используют при терапии антибиотиками, обладающими бактериостатическим действием, или при отсутствии эффекта от антибактериальной терапии у особой категории больных.

Частными случаями для определения МБК могут быть, например, бактериальный эндокардит, остеомиелит или генерализованные инфекции у пациентов с иммунодефицитными состояниями.

Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом.

Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной. В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК) (рис. 4.3).

При сравнительной простоте использования, данный метод также позволяет получать количественные данные, т.е. определять МПК и МБК. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.

Первоначально использование таких анализаторов вызывало определённый скептицизм среди исследователей вследствие их недостаточной гибкости (фиксированный набор АМП, трудности его изменения), а также возможности определения только пограничных (чаще всего - двух) концентраций АМП. Однако появление в последние годы новых модификаций данных приборов (например, Vitek　2), а также положительные результаты сравнительных исследований (в том числе и для "привередливых" микроорганизмов, например, пневмококков), внушают достаточный оптимизм для их дальнейшего применения. Особое значение автоматические анализаторы, вероятно, будут иметь в многопрофильных стационарах с большим количеством исследований, так как они позволяют определить чувствительность многих микроорганизмов в течение 4-8　ч.

Молекулярно-генетические методы исследования произвели революцию в диагностической микробиологии. С этим связан постоянный рост интереса к возможности их использования для выявления резистентности. Примером эффективных разработок в данной области может служить разработка метода ПЦР для выявления гена mecA, кодирующего белок, синтез которого обусловливает устойчивость к метициллину и всем другим бета-лактамных антибиотикам у стафилококков.

Однако не для всех микроорганизмов требуется определения чувствительности к АМП. Так, например, известно, что S.pyogenes сохраняет универсальную чувствительность к пенициллинам, что, естественно, не требует лабораторного подтверждения.

На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на:

• Чувствительные;
• Умеренно резистентные;
• Резистентные;

Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический (Таб. 4.4).

Таблица 4.4. Критерии интерпретации чувствительности бактерий

Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий.

Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии.

В клинике эти данные мы можем приложить следующим образом:

• чувствительные – рост возбудителей прекращается при терапевтических концентрациях лекарств в крови;
• умеренно резистентные – для угнетения роста микроорганизмов требуется максимальные дозы лекарственного препарата;
• резистентные - бактериостатический эффект может быть достигнуть только in vitro при высоких концентрациях лекарственного препарата, являющихся токсичными для человека.

На сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. В то же время, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.